Biomonitoring und Metabolismusforschung

Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAH) entstehen bei allen unvollständigen Verbrennungsreaktionen von organischem Material und kommen folglich ubiquitär in der Umwelt vor. Luftverschmutzung, gegrillte und geräucherte Nahrungsmittel, Zigarettenrauch und Verkehrsabgase sind Expositionsquellen, denen jeder Mensch ausgesetzt ist, so dass eine Hintergrundbelastung bei Personen der Allgemeinbevölkerung nachweisbar ist. Eine Vielzahl der PAH ist als krebserzeugend beim Menschen oder im Tierversuch eingestuft.

Am IPASUM werden derzeit im Rahmen von Forschungsprojekten verschiedene hydroxylierte Metabolite von PAHs, u.a. von Pyren, Phenanthren und Naphthalin, im Urin analysiert. Ziel zukünftiger Forschungsaktivitäten ist die Bestimmung insbesondere von PAH-Metaboliten mit einer hohen kanzerogenen Potenz.

Organophosphat- (OPP) und Carbamat-Pestizide zählen zu den Wirkstoffen, die in der Landwirtschaft am häufigsten als Pflanzenschutzmittel eingesetzt werden. Für das Biomonitoring von OPPs wurden bisher Methoden verwendet, bei denen Dialkylphosphate und deren entsprechende Thio-Derivate in Urin bestimmt werden. Diese Analysenverfahren ermöglichen jedoch keine Aussage über die Exposition gegenüber einzelnen Wirkstoffen. Allerdings liefern viele OPPs und einige Carbamate auch spezifische Biomarker für die Analyse von Humanurin. Folglich wurde eine Analysenmethode entwickelt, die die Erfassung eines breiten Spektrums phenolischer Metabolite von Organophosphaten und Carbamaten in Humanurin mittels Gaschromatographie Tandem-Massenspektrometrie (GC-MS/MS) ermöglicht.

Dabei werden  die Analyte nach enzymatischer Hydrolyse möglicher Glucuronid- und Sulfat-Konjugate mittels Festphasenextraktion von der wässrigen Urinmatrix in organisches Lösungsmittel überführt und mit N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamid in Anwesenheit von Pyridin derivatisiert. Anschließend werden die Reaktionsmischungen mittels GC-MS/MS, unter der Verwendung von Elektronenstoß-Ionisation, im sog. Multiple Reaction Monitoring Modus analysiert. Dafür wurden für jeden Parameter die Massenübergänge für Qualifier und Quantifier hinsichtlich selektiver Precursor- und Produkt-Ionen sowie deren kollisionsinduzierte Dissoziationsenergien optimiert.

Die  entwickelte gaschromatographische Methode ermöglicht die simultane Bestimmung von mindestens 19 Metaboliten. Die Validierung des Analysenverfahrens zeigte Nachweisgrenzen zwischen 0,1 und 0,4 µg/l. Variationskoeffizienten zwischen 1 und 9 % wurden für die Präzision in Serie ermittelt. Für die Präzision von Tag zu Tag wurden Werte zwischen 1 und 13 % bestimmt. Weiterhin lieferte die Methode Wiederfindungsraten zwischen 87 und 117 %.

Demnach zeigte das Analysenverfahren ein hohes Maß an Robustheit und Reliabilität und ermöglicht ein simultanes und spezifisches Biomonitoring eines weiten Spektrums von Pestiziden und Bioziden, deren Strukturen Arylfunktionen enthalten. Große Vorteile bietet die Multimethode deshalb in Fällen, bei denen die Expositionslage unklar ist.

Publikation

Denghel, H., & Göen, T. (2018) Simultaneous assessment of phenolic metabolites in human urine for a specific biomonitoring of exposure to organophosphate and carbamate pesticides. Toxicology Letters 298, pp. 33-41. doi: 10.1016/j.toxlet.2018.07.048

Sonne ist für den Menschen ein wichtiger Bestandteil des alltäglichen Lebens mit vielfältigen positiven Auswirkungen – sie birgt allerdings für die Haut die Gefahr kurz- und langfristiger Schäden durch UV-Strahlung. Vor diesen soll die Anwendung von Sonnenschutzmitteln schützen, so dass deren Anwendung für alle Bevölkerungsgruppen zum Schutz vor UV-Strahlung propagiert wird. Durch die breite Anwendung von Lichtschutzmitteln stellt sich aber auch die Frage nach einer möglichen Aufnahme in den menschlichen Körper.

Ziel unseres  Forschungsvorhabens ist zunächst eine Expositionsabschätzung hinsichtlich einer transdermalen Penetration der wichtigsten aktuell in Deutschland in Sonnenschutzmitteln verwendeten UV-Filter (Ethylhexylsalicylat, Octocrylen und Avobenzone) am Menschen. Im Rahmen einer in-vivo-Studie an freiwilligen Probanden wird die innere Belastung und die Ausscheidung dieser Substanzen und Metabolite bei gesunden Probanden nach der bestimmungsgemäßen Anwendung von gängigen Sonnenschutzmitteln unter realen Anwendungsbedingungen ermittelt. Durch zusätzliche Diffusionszellversuche sollen die Ergebnisse der in-vivo Bedingungen mit ex-vivo Methoden verglichen werden und dadurch Rückschlüsse auf alternative Aufnahmewege (z.B. orale Aufnahme, Hand-Mund-Kontamination) ermöglichen.

2,4-Di-tert-butyl-6-(5-chlorbenzotriazol-2-yl)phenol (Tinuvin 327, UV-327, CAS 3864-99-1) und 2-(2H-benzotriazol-2-yl)-4,6-di-tert-pentylphenol (Tinuvin 328, UV-328, CAS 25973-55-1) gehören zur Gruppe der phenolischen Benzotriazole. Sie werden als UV-Absorber in verschiedenen Kunststoffen und Lacken eingesetzt.

Beide Stoffe wurden auf Grund ihrer persistenten und bioakkumulativen Eigenschaften von der Europäischen Chemikalienagentur als „substance of very high concern“ (SVHC) eingestuft und in ein Kooperationsprojekt des Bundesumweltministerium und des Verbands der chemischen Industrie aufgenommen. Am Institut für Arbeits-, Sozial- und Umweltmedizin werden deshalb geeignete Analysenverfahren für Tinuvin 327 und 328 entwickelt. Im Zuge dessen wird auch der in vitro und in vivo Metabolismus der beiden Substanzen untersucht. Geeignete Metaboliten werden anschließend in die Methodenentwicklung aufgenommen.

Ziel ist die Entwicklung sensitiver und selektiver Verfahren, die eine spezifische Bestimmung von Tinuvin 327 und 328 Biomarkern ermöglichen.

Publikation:

Denghel, H., Leibold, E., & Göen, T. (2019) Oxidative phase I metabolism of the UV absorber 2-(2H-benzotriazol-2-yl)-4,6-di-tert-pentylphenol (UV 328) in an in vitro model with human liver microsomes. Toxicology in Vitro 60, pp. 313-322. doi: 10.1016/j.tiv.2019.06.012

Denghel, H., & Göen, T. (2020) Determination of the UV absorber 2-(2H-benzotriazol-2-yl)-4,6-di-tert-pentylphenol (UV 328) and its oxidative metabolites in human urine by dispersive liquid-liquid microextraction and GC–MS/MS. Journal of Chromatography B 1144, 122071. doi: 10.1016/j.jchromb.2020.122071

Fischer, C., Leibold, E., & Göen, T. (2020) Identification of in vitro phase I metabolites of benzotriazole UV stabilizer UV-327 using HPLC coupled with mass spectrometry. Toxicol. in Vitro, 104932

Denghel, H., Göen, T. (2021) Dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) and external real matrix calibration for the determination of the UV absorber 2-(2H-benzotriazol-2-yl)-4,6-di-tert-pentylphenol (UV 328) and its metabolites in human blood. Talanta 223, 121699. doi: 10.1016/j.talanta.2020.121699

Denghel, H., Hiller, J., Leibold, E, Göen, T. (2021) Human metabolism and kinetics of the UV absorber 2-(2H-benzotriazol-2-yl)-4,6-di-tert-pentylphenol (UV 328) after oral administration. Archives of Toxicology volume 95, pp 2677–2690. doi: 10.1007/s00204-021-03093-1